See veebileht kasutab küpsiseid kasutaja sessiooni andmete hoidmiseks. Veebilehe kasutamisega nõustute ETISe kasutustingimustega. Loe rohkem
Olen nõus
"Personaalse uurimistoetuse järeldoktori toetus (PUTJD)" projekt PUTJD626
PUTJD626 "Valkude ekspressiooni ja lokalisatsiooni reguleerivate multifosforüülimisel baseeruvate moodulite disain (1.02.2016−31.01.2018)", Nastassia Shtaida, Tartu Ülikool, Loodus- ja täppisteaduste valdkond, tehnoloogiainstituut.
PUTJD626
Valkude ekspressiooni ja lokalisatsiooni reguleerivate multifosforüülimisel baseeruvate moodulite disain
Design of multisite phosphorylation tags for fine tuning of protein expression level in yeast
1.02.2016
31.01.2018
Teadus- ja arendusprojekt
Personaalse uurimistoetuse järeldoktori toetus (PUTJD)
ETIS klassifikaatorAlamvaldkondCERCS klassifikaatorFrascati Manual’i klassifikaatorProtsent
1. Bio- ja keskkonnateadused1.1. BiokeemiaP310 Proteiinid, ensümoloogia1.5. Bioteadused (bioloogia, botaanika, bakterioloogia, mikrobioloogia, zooloogia, entomoloogia, geneetika, biokeemia, biofüüsika jt100,0
PerioodSumma
01.02.2016−31.01.201866 000,00 EUR
66 000,00 EUR

Projekti käigus disainiti valgujärjestused, mille koosseisus olevate spetsiifiliste aminohapete fosforüleerimisega suudeti muuta valgu taset rakus. Fosforüleeritavad järjestused disainiti analoogselt pärmi tsükliin Cln2 C-terminaalsele järjestusele, mis on võimeline rakus muidu stabiilset rohelist fluorestseeruvat valku (GFP) ebastabiilseks muutma. Valgujärjestused, mis sisaldasid 4-6 fosforüleerimissaiti, liideti reportervalgu GFP-ga (GFP-N2C) ning fluorestsentsmikroskoobiga mõõdeti nende valgutasemete muutmise efektiivsust. GFP-N2C afiinsuse tõstmiseks Cln2-CDK1 kompleksi suhtes liideti Sic1 valgust pärinev Cln2 seondumissait (VLLPP +/-5 aa) disainitud järjestuste C-terminaalsesse otsa. Fosforüleeritavad järjestused suutsid rakus efektiivselt reguleerida reportervalgu taset. GFP-ga liidetud järjestused näitasid sõltuvalt tüvedest ning eksperimendi tingimustest 20-60% madalamat fluorestsentsi võrreldes kontrolltüvedega, kus fosforüleerimissaitides asuvad aminohapped olid muteeritud alaniinideks. Cln2 baasil väljatöötatud fosforüleeritavad valgujärjestused on efektiivne meetod GFP valguekspressiooni kontrollimiseks. Küll aga selgus, et pärmi endogeenne Cln2 hakkab sarnaselt indutseeritavale Cln2-le mõjutama fosforüleeritavate valgujärjestuste lagunemist – rakkudes võis näha rakutsükli faasidest sõltuvat GFP tasemete ostsillatsiooni. Selle projekti raames loodud universaalset multifosforüleerimisjärjestuste tööriistakomplekti saab edaspidi kasutada pärmis ning muudes eukarüootsetes organismides valkude ekspressioonitasemete muutmiseks. Näiteks võiks seda tehnoloogiat rakendada rakkudes metaboliitide voogude uurmiseks läbi metaboolsete ensüümide tasemete reguleerimise. Samuti saaks seda kasutada sünteetilises bioloogias ensüümide tasemete reguleerimisel, et luua rakkudes uudseid aineringeid mõne meid huvitava molekuli tootmiseks. Samas tuleb loodud tööriistakasti rakendamisel silmas pidada rakutsükli etapist sõltuvat valguekspressiooni võnkumist.
A set of protein tags whose phosphorylation at multiple sites would cause changes in protein expression levels was developed in the course of project implementation. Phosphorylation tags were designed based on the sequence of C-terminal part of Cln2 cyclin whose ability to destabilize durable GFP protein was shown previously. Tags containing 4-6 phosphorylation sites were fused to GFP as a reporter (GFP-N2C) and their ability to affect GFP fluorescence were tested under the fluorescence microscope in microfluidics experiments. Cln2 docking site from Sic1 protein (VLLPP +/-5 aa) was added to the C-terminus of the designed tags in order to enhance affinity of the tagged protein with Cln2-CDK1 complex. The designed tags were proven to be an efficient tool for the regulation of protein expression. GFP fused to various tags showed 20-60% (depending on the strain and experimental conditions) of fluorescence level in comparison to that observed in the control strains, where phosphorylation sites were mutated to ALA. Cln2-based phosphorylation tags were found to be an efficient tool for the regulation of GFP expression levels. However, availability of a wild-type cyclin Cln2 at the background in GFP-N2C-expressing strains led to oscillation of the protein levels during different stages of yeast cell cycle. Thus, universal toolbox of multisite phosphorylation protein tags developed in the course of this project can be further used to adjust the expression of target proteins in yeast and other eukaryotic systems, and to study metabolite flux via various metabolic enzymes. The designed tags can also be exploited in more complex synthetic protein circuits in synthetic cells. However, potential oscillation of protein expression during different stages of the cell cycle needs to be taken into consideration.
Projekti käigus disainiti valgujärjestused, mille koosseisus olevate spetsiifiliste aminohapete fosforüleerimisega suudeti muuta valgu taset rakus. Fosforüleeritavad järjestused disainiti analoogselt pärmi tsükliin Cln2 C-terminaalsele järjestusele, mis on võimeline rakus muidu stabiilset rohelist fluorestseeruvat valku (GFP) ebastabiilseks muutma. Valgujärjestused, mis sisaldasid 4-6 fosforüleerimissaiti, liideti reportervalgu GFP-ga (GFP-N2C) ning fluorestsentsmikroskoobiga mõõdeti nende valgutasemete muutmise efektiivsust. GFP-N2C afiinsuse tõstmiseks Cln2-CDK1 kompleksi suhtes liideti Sic1 valgust pärinev Cln2 seondumissait (VLLPP +/-5 aa) disainitud järjestuste C-terminaalsesse otsa. Fosforüleeritavad järjestused suutsid rakus efektiivselt reguleerida reportervalgu taset. GFP-ga liidetud järjestused näitasid sõltuvalt tüvedest ning eksperimendi tingimustest 20-60% madalamat fluorestsentsi võrreldes kontrolltüvedega, kus fosforüleerimissaitides asuvad aminohapped olid muteeritud alaniinideks. Cln2 baasil väljatöötatud fosforüleeritavad valgujärjestused on efektiivne meetod GFP valguekspressiooni kontrollimiseks. Küll aga selgus, et pärmi endogeenne Cln2 hakkab sarnaselt indutseeritavale Cln2-le mõjutama fosforüleeritavate valgujärjestuste lagunemist – rakkudes võis näha rakutsükli faasidest sõltuvat GFP tasemete ostsillatsiooni. Selle projekti raames loodud universaalset multifosforüleerimisjärjestuste tööriistakomplekti saab edaspidi kasutada pärmis ning muudes eukarüootsetes organismides valkude ekspressioonitasemete muutmiseks. Näiteks võiks seda tehnoloogiat rakendada rakkudes metaboliitide voogude uurmiseks läbi metaboolsete ensüümide tasemete reguleerimise. Samuti saaks seda kasutada sünteetilises bioloogias ensüümide tasemete reguleerimisel, et luua rakkudes uudseid aineringeid mõne meid huvitava molekuli tootmiseks. Samas tuleb loodud tööriistakasti rakendamisel silmas pidada rakutsükli etapist sõltuvat valguekspressiooni võnkumist.